黃酮類化合物是植物體內(nèi)一類低相對分子質(zhì)量的次級代謝產(chǎn)物，大都呈黃色或淡黃色。黃酮類化合物在植物體內(nèi)多數(shù)與糖結(jié)合成糖苷形式存在，少數(shù)以游離苷元形式存在。黃酮類化合物作為一種功能成分，具有優(yōu)良的抗氧化活性及多種藥理和保健性能，如黃芩、洋薊等有護(hù)肝功效，異黃酮能美容、預(yù)防衰老。近年來國內(nèi)外相繼開發(fā)出黃酮類的茶葉、牙膏、口香糖等產(chǎn)品，目前更注重研發(fā)純度更高的保健品和藥品。研究發(fā)現(xiàn)大豆、花生、油菜籽中黃酮類化合物含量豐富，且來源廣泛、價格低廉，適合作為提取黃酮類化合物的原料。本文對此類黃酮類化合物提取方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行詳細(xì)介紹。
黃酮類化合物簡介
黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜、水果及藥用植物的花、果、葉部位，以蕓香科、唇形科、豆科、傘形科、銀杏科、菊科植物中居多。根據(jù)C3部分形成方式(氧化、取代、成環(huán))的差異，可將其分為黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、查兒酮類、異黃酮類、花色素、雙黃酮類等。不同植物中黃酮類化合物的種類差異較大：黃酮類、二氫黃酮類廣泛分布于被子植物;黃酮醇類(山萘酚和槲皮素)和二氫黃酮醇類多分布于雙子葉植物，二氫黃酮醇類還分布于豆科、薔薇科植物;查兒酮類主要分布于菊科、豆科、萵苣苔科植物;異黃酮類和花色素類多分布于被子植物，如豆科、桑科及鳶尾科;黃烷類主要分布于含鞣質(zhì)的木本和蕨類植物;橙酮類多存在于玄參科、菊科、萵苣苔科及單子葉植物;雙黃酮類分布于除松科以外的裸子植物。黃酮類化合物的性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，在實際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)植物及黃酮類化合物的種類、結(jié)構(gòu)，選擇合適的提取方法。
油料作物中的黃酮類化合物
油料作物是我國最重要的農(nóng)產(chǎn)品之一，也是人們的生活必需品，可分為草本油料作物和木本油料作物，我國以草本油料作物為主，其中大豆、花生和油菜籽的產(chǎn)量占國內(nèi)油料總量的80%，是居民消費的主要品種。這3種油料作物不僅經(jīng)濟(jì)易得，而且黃酮類化合物含量豐富，可作為黃酮類化合物的提取原料。其他油料作物由于種植面積較少或黃酮成分含量有限，開發(fā)較少，因此本文主要針對大豆、花生和油菜籽，分析其中的黃酮成分及合適的提取方法。
化學(xué)法、光譜分析、HPLC是功能物質(zhì)常用的分析技術(shù)，常被用來檢測油料中的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)大豆莢殼、豆粕、豆渣中均含較多黃酮成分，龔凌霄、Mirzaei等運用HPLC、化學(xué)法、紫外光譜對大豆中黃酮化合物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)大豆中主要含異黃酮，如大豆黃酮苷、大豆黃素、染料木苷和染料木素等，且其含量與大豆品種有很大關(guān)系。紅衣是花生中黃酮成分最豐富的部位，張秀堯等運用紅外光譜和紫外光譜，杜蕾利用有機化合物的官能團(tuán)反應(yīng)，對花生衣進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮成分主要為花色苷、黃酮、二氫黃酮。除紅衣外，花生植株(殼、莖、葉、根)也含有黃酮成分，以花生殼中含量最多，主要為木犀草素和圣草酚等。油菜中油菜花粉富含黃酮化合物，楊必成等采用HPLC技術(shù)對油菜花粉進(jìn)行分析，結(jié)果顯示油菜花粉中主要黃酮成分為槲皮素、山萘酚、異鼠李素。此外，油菜籽餅中也含有少量異黃酮成分。
黃酮類化合物提取方法
黃酮類化合物的提取方法主要有有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、酶提取法、半仿生提取法等，目前油料作物中黃酮類化合物的提取方法主要為前4種，其特點如表1所示。
1.有機溶劑提取法
有機溶劑提取法利用相似相溶的原理，依據(jù)植物中有效成分在不同溶劑中溶解性的差異，將有效成分從原料中浸。常用的溶劑有乙醇、甲醇、乙醚等，因最常用的溶劑是乙醇，此法被稱為醇提法。醇濃度是影響此法提取效果的決定性因素，高濃度乙醇(90%～95%)適用于提取黃酮苷元類，低濃度乙醇(60%)適用于提取黃酮苷類。
有機溶劑提取法是目前應(yīng)用最廣，唯一實現(xiàn)工業(yè)化的提取方法。趙衛(wèi)星等以80%乙醇為溶劑提取大豆莢殼中類黃酮，最優(yōu)條件下以10∶1液料比在70℃條件下提取24h，提取率可達(dá)8.58%。運用此法提取豆粕中異黃酮，其粗提物經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化后，產(chǎn)品純度顯著提高。以60%乙醇為有機溶劑，以1∶300料液比在pH2.5和40℃條件下提取黑花生衣45min，總黃酮提取率為74.7mg/g。以50%乙醇提取花生粕3h，最優(yōu)條件下總黃酮提取率為1.60mg/g。以95%乙醇提取油菜蜂花粉中黃酮物質(zhì)，經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山萘酚、異鼠李素三者含量分別為0.928%、0.295%、0.0834%。
有機溶劑提取法操作簡單、生產(chǎn)成本低、浸出雜質(zhì)少，而溫度、時間、料液比是影響提取率的主要因素。為了獲得高提取率，往往需要提高溫度，延長提取時間，但容易破壞原料中的黃酮類化合物，導(dǎo)致其生物活性降低，因此有機溶劑提取法適于提取熱敏性較低的物料。若能與其他技術(shù)如超聲波、微波等相結(jié)合，縮短提取時間、降低提取溫度，將更有助于黃酮類化合物的提取。
2.超聲波輔助提取法
超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生強烈振動、高加速度、空化以及攪拌作用加速提取液的振蕩，促進(jìn)溶質(zhì)擴散，破壞細(xì)胞膜促進(jìn)黃酮類化合物的釋放與溶出，目前在食品工業(yè)中應(yīng)用較為廣泛。
超聲波輔助提取法的影響因素主要為料液比、超聲波功率、提取溫度和提取時間。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物提取4因素對提取效果的影響主次順序為：超聲波功率>提取溫度>提取時間>料液比。王桃云等以料液比1∶25、70%乙醇、超聲波功率270W萃取豆莢20min，浸提3次，總黃酮類得率為8.49%，經(jīng)分析產(chǎn)品有較強的體外抗氧化活性。楊歡等以料液比1∶30、70%乙醇、超聲功率120W、70℃提取花生殼40min，加入4g/LSDS活性劑后，黃酮提取率達(dá)到2.15%，比單獨超聲提取提高了51.4%。楊潔等[26]以料液比1∶30、76%乙醇、超聲溫度51℃提取油菜蜂花粉33min，得率為1.89%，經(jīng)HPLC進(jìn)一步分析鑒定，油菜蜂花粉提取物中約有9種黃酮苷元，提取較為徹底。
3.微波輔助提取法
微波輔助提取法利用不同物質(zhì)吸收微波能力的差異，使得樣品中某些組分被選擇性加熱，從而獲得巨大能量，掙脫束縛從基體物質(zhì)中分離出來。微波依據(jù)介質(zhì)性質(zhì)的不同，將產(chǎn)生反射、吸收以及穿透等現(xiàn)象，可快速破壞細(xì)胞壁，直接作用于分子，加劇分子之間的碰撞、擠壓，使有效成分快速浸出。
影響微波輔助法提取效果的因素主要有提取溶劑、提取時間、微波功率、提取溫度等。與傳統(tǒng)溶劑相比，微波輔助提取法能在極短時間萃取更高含量的大豆異黃酮，且提取物活性較好。王舒等以微波和溶劑法提取豆粕中異黃酮，******條件下得率分別為26.86、7.518mg/g，微波法得率明顯高于溶劑提取法的。對大豆中大豆黃素和染料木素的回收率進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)二者回收率高達(dá)(94±8)%和(97±5)%。運用該法提取花生殼中黃酮成分時，與乙醇回流法相比，提取時間由4h縮短至4min，黃酮類化合物提取量提高了2.4倍。以料液比1∶30、功率515W微波輻照花生殼120s，黃酮類化合物提取率高達(dá)83.7%。研究此法提取花生殼所得黃酮成分的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)提取物對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除值分別為0.78、6.66、5.12mg/mL，抗氧化性較高。采用此法提取油菜花粉中總黃酮，******條件下提取率為(2.64±0.05)%;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DPPH自由基半清除質(zhì)量濃度為0.325mg/mL。
微波輔助提取法加熱迅速，操作簡便，與傳統(tǒng)有機溶劑提取法相比，極大縮短了提取時間，因此可避免高溫對有效成分的破壞，使提取物保持良好的抗氧化活性。但該法不適于提取熱敏性成分，因為微波加熱會導(dǎo)致這些成分的變性、失活，此外，提取物中可能會有溶劑殘留，且微波穿透原料內(nèi)部時其強度會發(fā)生衰減，這些問題仍亟待解決。
4.超臨界流體萃取法
超臨界流體萃取技術(shù)利用不同密度超臨界流體對物質(zhì)溶解能力的差異，達(dá)到分離純化的目的。CO2價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、安全無毒，是超臨界流體萃取法常用的萃取劑之一。但是由于萃取劑極性弱、溶解能力差，容易導(dǎo)致提取率低。在超臨界萃取的同時，引入夾帶劑或采取多級萃取、分離和連續(xù)固體處理等技術(shù)，可解決這些問題;夾帶劑還有助于實現(xiàn)粗提物的分離純化。常用的夾帶劑有乙醇、水和甲醇等。將80%改性甲醇作為助溶劑，******條件下豆粕異黃酮回收率高達(dá)87.3%;Yu等以大豆胚軸為提取原料，以35MPa、CO2流速5L/min在45℃萃取2h，異黃酮提取率為21.8mg/g;Pyo等對此法和有機溶劑萃取大豆異黃酮的提取率進(jìn)行比較，二者染料木素的提取率分別為0.6599mg/g和0.6763mg/g，雖然前者比后者稍低，但前者樣品處理步驟少，樣品損失少，無有機溶劑參與，安全清潔;王哲等對大豆異黃酮的溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波萃取法以及微波萃取法進(jìn)行了對比研究，結(jié)果表明超臨界流體萃取法提取率和純度高，清潔高效，但對設(shè)備要求較高。
超臨界流體萃取法選擇性好、回收率高、能耗低，作用時間短，能避免高溫對黃酮類化合物的破壞。目前此法在提取大豆異黃酮中展現(xiàn)了諸多優(yōu)越性，但其在花生和油菜籽等其他油料作物中應(yīng)用較少，主要是因為此法工藝復(fù)雜，花生和油菜花粉中黃酮成分含量有限，提取成本較高，因此若超臨界流體萃取法能改善工藝、降低成本，則必將在黃酮成分的提取中發(fā)揮優(yōu)勢。
5.其他提取方法
黃酮類化合物的提取方法還有很多，如酶提取法、半仿生提取法等。酶提取法安全高效、反應(yīng)條件溫和、專一性強，主要應(yīng)用于黃酮物質(zhì)被細(xì)胞壁包裹不易提取的物料，如山楂等，酶解破除細(xì)胞壁后，黃酮物質(zhì)充分暴露，更易被充分提取。半仿生提取法是一種新型的提取方法，此法模擬口服給藥及藥物在胃腸道中的轉(zhuǎn)運過程，對原料進(jìn)行連續(xù)提取，在藥物中黃酮成分的提取發(fā)揮了較大優(yōu)勢。對這兩種技術(shù)在油料作物中黃酮成分的提取和應(yīng)用，期待有深入的開發(fā)探究。
大豆、花生、油菜籽3種主要油料作物中黃酮類化合物的提取，有機溶劑提取法應(yīng)用最廣，已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化，但提取溫度較高，耗時較長，容易破壞提取物的活性。超聲波輔助提取法和微波輔助提取法在提取大豆、花生、油菜籽中黃酮時均展現(xiàn)了諸多優(yōu)勢，提取效率高、安全性好，能避免高溫對有效成分的破壞，保持其原有活性。因此，溶劑提取與超聲波、微波等其他技術(shù)聯(lián)用，是目前較好的應(yīng)用選擇。超臨界流體萃取法在大豆異黃酮的提取中優(yōu)勢明顯，但生產(chǎn)成本高，萃取工藝較為復(fù)雜。其他提取技術(shù)如酶提取法、半仿生提取法是優(yōu)良的新興工藝，很有必要將其運用到油料作物中黃酮類物質(zhì)的提取，但其提取技術(shù)還有待進(jìn)行深入的開發(fā)探究。